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    DEAE-Sephadex A-50提取法純化多克隆抗體

    發布時間: 2010-10-28  點擊次數: 2144次

    DEAE-Sephadex A-50(簡稱A-50)為弱堿性陰離子交換劑,經過NaOH處理將Cl-型轉為OH-型后,可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白屬中性蛋白,等電點為pH6.85~7.5,其余均屬酸性蛋白。在溶液為pH8.0時,酸性蛋白均被A-50 吸附。從而可分離純化IgG。

    1. 批量吸附法
    此法可在1天內完成提取過程,純化前后樣品體積變化不大,所得IgG無變性現象,抗體效價亦無明顯降低。制品可達PAGE及免疫電泳純。適用于提純人、羊、兔等血清中的IgG。

    【材料和試劑】
    (1)DEAE-Sephadex A-50。
    (2)PB緩沖液:0.01mol/L,pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。

    【操作步驟】
    (1)A-50的預處理:稱取4~6g A-50懸浮于500~1000ml蒸餾水中,1h后傾去上層細粒。然后將A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液(60~100ml)中,攪拌后靜置30min,以蒸餾水洗至中性,再用0.1mol/L NaH2PO4同上操作過程處理,蒸餾水洗至中性。zui后用0.01mol/L,pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(PB)平衡,減壓抽干,保存備用。

    (2)吸附提取:取15ml血清加等量0.01mol/L,pH6.5 PB稀釋至30ml(也可不稀釋),加入1/4體積濾干的DEAE-Sephadex A-50(相當于干重1g)混合。室溫(或4℃)浸泡1 h后過濾,收集濾液。再加入同樣體積的DEAE-Sephadex A-50重復上述處理過程共3次,亦可在血清內加入過量DEAE-Sephadex A-50吸附處理一次。收集濾液合并,即為提純的IgG制品。或再透析去鹽,濃縮、凍干保存備用。

    2.A-50柱層析法
    【材料和試劑】
    (1)DEAE-Sephadex A-50。
    (2)待純化標本:雜交瘤腹水或培養上清,免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
    (3)1.5×50cm 層析柱;透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
    (4)PB緩沖液:0.1mol/L,pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。

    【操作步驟】
    (1)A-50經酸堿處理,平衡至中性后,浸泡于0.1mol/L,pH7.4 PB中,置4℃冰箱儲存備用。
    (2)裝柱:同DE52。
    (3)平衡:松開出水口螺旋夾,以PB平衡,控制流速為15滴/min,待洗脫液與流出液之pH值達到一致時,停止平衡。
    (4)加樣、洗脫、收集與濃縮:基本上同DE52,以0.1mol/L PB洗脫。
    用過的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗脫回收。洗至流出液中無蛋白(OD280nm<0.04)后再用蒸餾水洗至中性,加入0.02%疊氮鈉于4℃保存備用。
     

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