細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞凍存

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：細(xì)胞室及工作臺(tái)紫外線照射15min；培養(yǎng)液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒溫水浴箱37℃預(yù)熱備用；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在凍存前一天換液

2．用吸管吸出培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2遍吸出沖洗液，加入適量胰蛋白酶消化。

3. 適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。

4. 用吸管將培養(yǎng)液加入凍存管中，離心(1000r/min，10分鐘)。

5. 去上清液，加入與細(xì)胞懸液等量的凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻

6. 冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16～18小時(shí)(或隔夜)---液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20℃不可超過(guò)1h，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

7．記錄每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

細(xì)胞復(fù)蘇

室內(nèi)紫外消毒；培養(yǎng)基、PBS于37℃恒溫水浴預(yù)熱備用。
自液氮罐中取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，離心。
去上清，加入培養(yǎng)基，吹打，然后移入培養(yǎng)瓶中，用培養(yǎng)基清洗凍存管，清洗液也移入培養(yǎng)瓶中。
于培養(yǎng)瓶中加入適量培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
記錄復(fù)蘇日期；次日換液。