ELISA法檢測細(xì)胞間黏附分子-1

ELISA法檢測細(xì)胞間黏附分子-1

細(xì)胞黏附分子（ICAM）是存在于細(xì)胞表面的一類具有復(fù)雜功能的糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互黏附，參與眾多的病理生理過程。目前，研究較多的黏附分子主要有免疫球蛋白超家族、整合素家族、選擇性家族、Cadherin家族等。細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一員，由內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)，其配體是白細(xì)胞黏附分子CD18家族中的2個成員：即淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原—1[lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-l（CDua／CDls）]和巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體-1[Mac-1（CD11a／CD18）]。正常肝組織中僅竇周細(xì)胞、門靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量ICAM-1表達(dá)，肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞多為陰性。炎癥反應(yīng)過程中，ICAM-1是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）接觸過程中起中心作用的一種細(xì)胞黏附分子，而炎癥細(xì)胞表面的LFA-1與靶細(xì)胞膜上的ICAM-1結(jié)合是*的過程。近年來，許多研究表明：ICAM-1與LFA-l介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附，與肝細(xì)胞壞死的發(fā)生有十分密切的關(guān)系，而阻斷它們之間的相互作用或干擾它們的表達(dá)可能成為阻止肝細(xì)胞發(fā)生壞死的一種成功策略。由于ICAM-1與病毒性肝炎關(guān)系的研究是近年來肝病研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，檢測方法和正常參考值的確立尚待完善。
[檢測方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法。抗人slCAM-1單克隆抗體包被于微孔板上，加入標(biāo)本／標(biāo)準(zhǔn)品，使之與板上抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的單克隆抗體，未結(jié)合的部分被洗去，加入HRP的底物，若反應(yīng)孔中有slCAM-1，將出現(xiàn)顯色反應(yīng)，加終止液終止反應(yīng)。在450nm處測OD值，sI-CAM-1濃度與OD值之間成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中ICAM-l的濃度。
[試劑]
1．包被有抗人slCAM-1抗體的微孔板1塊
2．HRP結(jié)合的抗人slCAM-1單克隆抗體0．1ml／瓶
3．0．5ml 100ng／ml slCAM-1標(biāo)準(zhǔn)品2瓶
4．50ml濃縮洗滌液20X1瓶
5．5ml濃縮檢測緩沖液20Xl瓶
6。12ml樣品稀釋液1瓶
7．12ml TMB底物溶液1瓶
8．12ml終止液1瓶
9．封板膠紙2張
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測
[檢測步驟]
1.使用前先混勻所有試劑，應(yīng)注意避免起泡。
2．確定好空白、標(biāo)準(zhǔn)及待測所需孔數(shù)（每一份標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白及隨機(jī)選擇的對照應(yīng)測兩次）。
3．從已平衡至室溫的密封袋中取出所需的板條，洗板。
4．加樣，在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100u1樣品稀釋液，在待測孔中加入90u1樣品稀釋液。
5．每份標(biāo)本取10ul加入待測孔中，混勻。
6．在所有孔中加入50ul已稀釋的HRP結(jié)合物，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，置于100rpm搖床上室溫環(huán)境中（18～25℃）孵育1h，洗板。
7．在所有孔中加入100ul TMB底物稀釋液，包括空白孔。置于100rpm搖床上，避光室溫環(huán)境中（18～25℃）孵育約10min（視顯色深淺靈活掌握）。
8．加入終止液（100u1／孔）終止反應(yīng)，混勻后即刻測量OD450值。
注意：若孵育時未使用搖床則所獲OD值較低，但仍然有效。
[注意事項(xiàng)]
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30rain后方可使用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2．酶標(biāo)板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30～60s的洗滌浸泡時間。
3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。
4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應(yīng)注意安全。
5．每批樣本應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6．若標(biāo)本OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。
[臨床意義]
1．對TNF-β治療的乙型肝炎感染，slCAM是很好的診斷指標(biāo)。
2．眼葡萄膜炎、血管球性腎炎、HIV-1感染時，血漿slCAM-1升高。