上海研域生物原代細胞技術實驗原理及傳代操作

在我們培養(yǎng)原代細胞的過程中，對細胞進行傳代是一項常規(guī)的操作，傳代可以幫助我們擴大細胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時也避免了因細胞進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。今天我們簡單講講傳代操作（主要針對貼壁細胞）。

實驗原理：

當培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度后，將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細胞會在培養(yǎng)瓶中長成致密單層 (懸浮細胞會充滿整個體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部，此時如果不及時進行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細胞將逐漸走向衰老、死亡，將培養(yǎng)的細胞從一個容器以適當比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。

首先，我們需要準備好相應的實驗器材：裝有75%醫(yī)用消毒酒精的酒精噴壺、PBS緩沖液、胰酶、含血清培養(yǎng)基、巴氏吸管、移液器、離心管、廢液缸。至于其他的超凈臺、培養(yǎng)箱、離心機等都是一個細胞間的基礎設施。

然后，我們需要把我們準備的器材放入超凈臺，打開紫外照射滅菌，值得注意的是若是培養(yǎng)的細胞對溫度比較敏感，可以將含血清的培養(yǎng)基瓶子（包括盛放胰酶的瓶子）放入37℃的水浴箱使得培養(yǎng)基溫度在37℃，再轉(zhuǎn)移到超凈臺紫外滅菌，當然一般的細胞對培養(yǎng)基的溫度不是很敏感，不用對培養(yǎng)基加溫也是可以的。另外，細胞培養(yǎng)間也需要紫外照射半小時左右。

操作步驟：

1、紫外照射滅菌后，我們應該穿好滅菌服，戴好滅菌手套和口罩。

2、從培養(yǎng)箱取出細胞培養(yǎng)瓶（一般選擇處于對數(shù)期的細胞），用酒精噴壺在培養(yǎng)瓶表面噴灑75%酒精消毒，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶到超凈臺。

3、打開蓋子，輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，用巴氏吸管加入適量PBS緩沖液洗滌1-2次（注意從側(cè)壁加入，以免沖掉細胞），棄去PBS緩沖液。

4、可用移液器加入1-2ml胰酶（具體量根據(jù)實驗需要確定，此處僅為參考用量），“十字"晃動，使胰酶充分接觸細胞。

5、將加入胰酶的細胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡載物臺，鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓且大量脫落時，準備終止消化，用75%的酒精噴灑培養(yǎng)瓶表面，轉(zhuǎn)移到超凈臺。

6、用移液器（或巴氏吸管）加入等量含血清培養(yǎng)基，終止消化。移液器（或巴氏吸管）充分吹打（動作也不要太猛，畢竟細胞也是蠻脆弱的），使細胞能夠脫落。

7、將培養(yǎng)瓶中混合液體轉(zhuǎn)移至離心管中（離心管規(guī)格根據(jù)實驗需要確定），配平，離心5分鐘左右（離心機轉(zhuǎn)速根據(jù)細胞種類而定，常見的有1000rpm/min）

8、離心好后，用酒精噴壺噴灑離心管表面，轉(zhuǎn)移進超凈臺，打開蓋子，將上清液倒入廢液缸。

9、加入適量體積含血清培養(yǎng)基，用移液器或巴氏吸管輕輕吹打，制成細胞懸液。

10、將細胞懸液分裝進2個（或多個）潔凈滅菌培養(yǎng)瓶，加入適量培養(yǎng)基，蓋好蓋子

1、將分裝好的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡載物臺，觀察細胞情況，細胞應保證一定數(shù)量，數(shù)量太少會影響生長情況。

12、在培養(yǎng)瓶上做標記，注明傳代時間，細胞種類，操作人員等信息。在放入培養(yǎng)箱之前應再次用酒精噴一噴培養(yǎng)瓶表面，然后應記得整理操作臺，用75%酒精擦拭超凈臺臺面，清理廢液和垃圾。

注意，全程嚴格無菌操作！

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