ELISA試劑盒直接法與間接法的區別

ELISA試劑盒可用于測定抗原,也可用于測定抗體.在這種測定方法中有三個必要的試劑
1）固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;
（2）酶標記的抗原或抗體,稱為"結合物"（conjugate）;
（3）酶反應的底物.根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件,可設計出各種不類型的檢測方法. 
ELISA可分類是根據抗原抗體的結合情況來分類的。 
主要有以下幾種類型:（直接法也稱一步法） 
1 雙抗體夾心法測抗原 
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下: 
1） 將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體.洗滌除去未結合的抗體及雜質. 
2） 加受檢標本,保溫反應.標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物.洗滌除去其他未結合物質. 
3） 加酶標抗體,保溫反應.固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合.*洗滌未結合的酶標抗體.此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關. 
4） 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產物.通過比色,測知標本中抗原的量.在臨床檢驗中,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法.如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物.如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物.這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步檢測. 
ELISA試劑盒 在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成"夾心復合物".類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象,此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2,圖1-4）,如按常法測讀,所得結果將低于實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）,因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果.因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等）時,應注意可測范圍的zui高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應. 
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物.但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題. 
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合.用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應.采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標。 
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心. 2 雙抗原夾心法測抗體 
反應模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體.與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.此法中受檢標本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法.乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法.本法關鍵在于酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法. 
3 間接法測抗體 
間接法是檢測抗體常用的方法.其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法
操作步驟如下: 
1）將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原.洗滌除去未結合的抗原及雜質.
2）加稀釋的受檢血清,保溫反應.血清中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物.經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去. 
3）加酶標抗抗體.可用酶標抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體.固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合,從而間接地標記上酶.洗滌后,固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關. 
4）加底物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷.間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法.間接法成功的關鍵在于抗原的純度.雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果,但應盡可能予以純化,以提高試驗的特異性.特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質,例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應.抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質,例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗中也發生假陽性反應.另外如抗原中含有無關蛋白,也會因竟爭吸附而影響包被效果. 
ELISA試劑盒 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強,非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次,以封閉（blocking）固相上的空余間隙.另外,在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過高的陰性本底影響結果的判斷.