測序常見問題及其分析

　1、PCR產(chǎn)物測序時(shí)出現(xiàn)重疊峰

　　問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點(diǎn)（1-1）或兩個(gè)位點(diǎn)（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼）

　　圖1-1

　　圖1-2

　　解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序。

　　問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）

　　圖2

　　解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序，便可解決。

　　問題圖3（測序引物有堿基缺失）

　　測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。

　　解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化

　　2、克隆測序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊

　　原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測序的菌液污染

　　解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)粒或送菌液再次測序。

　　3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)

　　模板中有雜合型突變，也就說模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形，然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰（如圖中箭頭所示）。

　　解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測序。

　　4、polyA/T和C/Gcluster導(dǎo)致的套峰和測序信號衰減

　　圖4-1

　　圖4-3

　　圖4-4

　　RACE測序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。

　　C/Gcluster在PrV基因組測序時(shí)遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時(shí)候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服務(wù)。

　　5、基因中含有重復(fù)序列

　　可能的原因:樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會(huì)導(dǎo)致Frame滑動(dòng)，較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長的重復(fù)序列會(huì)使定序信號衰減。

　　解決辦法:反向測序有時(shí)能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域（但不是一定都能夠），通過多次的測序結(jié)果比對，拼接可以得到全序列結(jié)果。